charming

1. 목적

cell에 새로운 영양소 공급

2. 사용 재료

기구: pipette, tip, pipette aid, glass pipette, conical tube

시약: HBSS, media

3. 방법

① flask에 HBSS를 추가 후 washing한다.

② washing한 media를 conicla tube로 옮기고 centrifuge 한다.

③ cell을 suction하지 않게 주의하고, 상층액을 suction한다.

④ 적당량의 media를 pellet과 섞어준다.

⑤ trypan blue를 사용해 cell counting한다.

⑥ density를 계산하고, 적정량을 dish에 골고루 seeding한다.

4. 고찰

① rpm, rcf 변환 및 차이

rpm(rev per min)은 분당 회전수이며, 속도의 단위다. 로터의 길이가 다를 시 같은 rpm이라도 원심력이 다르다.

② HBSS pH

HBSS의 phenol red를 통해 pH를 짐작할 수 있다.

HBSS는 붉은색을 띠는데, 세포호흡으로 발생한 이산화탄소가 HBSS에 녹아 pH가 낮아지면(산), 노란색을 띤다.

pH가 높아지면(염기) 자주색을 띤다.

③ trypan blue 염색 원리

trypan blue 입자는 확산을 통해 세포 내로 유입된다. 살아있는 세포는 exocytosis 작용을 통해 trypan blue를 세포 밖으로 배출해 염색되지 않는다.

죽은 세포는 exocytosis 작용을 할 수 없어 파란색으로 염색된다.

1. 목적

cell에 새로운 영양소 공급

2. 사용 재료

기구: pipette, tip, pipette aid, glass pipette

시약: HBSS, media

3. 방법

① flask에 있는 old media를 suction한다.

② HBSS를 벽면을 따라 넣어 washing한다.

③ cell에 맞는 media를 넣어준다.

④ flaming후 incubator에 보관한다.

4. 고찰

① HBSS

HBSS는 cell washing용이나, 단기간 보관용으로 쓰이는 buffer이다. cell이 죽지 않을 정도의 salt가 포함되어있다.

1. 목적

freezing해둔 cell의 사용을 위해 녹인다.

2. 사용 재료

기구: pipette, pipette aid, tip, glass pipette, conical tube, T-flask, hemocytometer

시약: HBSS, DMEM-HG, trypan blue

3. 방법

① water bath에 HBSS, DMEM을 넣고 37℃로 설정해 데워둔다.

② 동결용 vial은 알코올로 닦은 후 clean bench 안에서 열었다 닫은 후 water bath에서 녹인다.

③ conical tube에 HBSS 10ml을 덜어둔다.

④ 동결용 vial이 다 녹기 전 water bath에서 꺼내 손의 열감으로 녹인다. 

⑤ cell을 천천히, 남김없이 HBSS에 넣는다.

⑥ HBSS(+cell)을 centrifuge 한다.

⑦ HBSS suction후 적당량의 DMEM-HG와 pipetting한다.

⑧ trypan blue와 cell lysate를 각 10μl씩 따서 hemocytometer를 이용해 cell counting한다.

⑨ T-flask working volume을 맞춰 DMEM-HG를 넣는다.

⑩ density 계산 후 pipetting해 T-flask에 seeding한다.

⑪ labeling하고 incubator에 둔다.

⑫ thawing 다음날 media change한다.

4. 고찰

① Full name

HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)

DMEM-HG(Dulbecco's Modified Eagle Medium- High Glucose)

② cell counting

hemocytometer는 1ml을 기준으로 한다.

위 사진에서 1mm 하나당 부피는 0.1μl이다. (0.1*1*1)

따라서 1ml로 맞추기 위해 10^4를 곱한다. (0.1μl*10^4 = 1000μl = 1ml)

-상세 계산식

(counting된 cell)*(넣은 DMEM-HG ml)*2(trypan blue 희석 보완)*10^4/(counting한 칸 수)