charming

1. gene의 염기서열 전체를 ctr + c, ctr + v해서 텍스트 파일로 불러온다.

2. forward primer, reverse primer의 염기서열을 표기한다.

3. ctr + F로 forward primer를 찾아 염기서열이 있는지 확인 후 색을 다르게 해 표시한다.

4. reverse는 순서를 반대로 바꿔준다(ex. aagttc - cttgaa)

5. 순서를 바꾼 염기서열에 상보적인 염기로 바꾸고, ctr + F로 염기서열이 있는지 확인 후 색을 다르게 해 표시한다.

6.  5 to 3 방향에 주의해 primer를 주문한다.

PRIMER 확인하기

1. NCBI 홈페이지의 우측 상단 Popular Resource- BLAST를 클릭한다.

방법 ①

2. 스크롤해서 Primer-BLAST를 클릭한다.

3. Enter accession, gi, or FASTA sequence 란에 Forward, Reverse primer 순으로 입력한다.

※ Forward 입력 후 한줄 띄우고 Reverse 입력!

4. 하단의 Get primers를 클릭한다.

5. products on target tem~ 가 원하는 gene에 맞는 primer인지 확인한다.

방법 ②

2. Web BLAST의 Nucleotide BLAST를 클릭한다.

3. Enter accession, gi, or FASTA sequence 란에 Forward, Reverse primer 순으로 입력한다.

※ Forward 입력 후 한줄 띄우고 Reverse 입력!

4. Choose Search Set의 database를 Human genomic + transcript에 체크한다.

5. Program Selection의 Optimize for를 Optimize for Somewhat similar sequences (blastn)에 체크한다.

6. BLAST를 클릭해 Sequences producing significant alignments에서, 원하는 gene에 맞는 primer인지 확인한다.

※ Query cover값이 높으면 많이 일치한다는 것을 나타낸다. 따라서 높을수록 좋다.

PRIMER 짜기

1. primer 3 plue(http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi ) 페이지와 NCBI(생물공학 정보센터, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ )에 접속한다.

2. NCBI 페이지에서, 우측 상단 Popular Resources의 Nucleotide를 클릭한 후 원하는 gene의 이름을 입력한다.

※ cell 이름으로 검색 시, data가 너무 방대해 원하는 gene을 찾기 힘들다. 따라서 gene이나 primer의 이름으로 검색한다. (ex. chondrocyte X, aggrecan O)

3. 검색 후, 우측 상단 Results by taxon을 select한다. (human cell 실험시에는 homo sapiens 클릭)

4. 검색 결과 뜬 Item 중, mRNA, complete cds라고 되어있는 것을 클릭한다.

※ mRNA, complete cds 결과가 여러 개일 경우에는 어떤 것을 선택해도 무방하다.

mRNA, complete cds라고 된 Item이 없으면 논문을 참고(PubMed 클릭)해 확인 후 transcript varient 사용한다.

5. origin 전체를 복사한 후 primer 3 plus의 Main- paste source sequence below에 붙여넣는다.

※ sequence 입력 후 Pick primer에서 warning이 뜰 경우, 숫자와 공백을 없애고 입력해본다.

NCBI에서 Item을 클릭할 때, FASTA 클릭시 공백이 없는 sequence가 나온다.

6. general settings에서 primer size, primer Tm, primer GC% 등의 조건을 입력한다.

※ 보통 primer size: 18/20/20, Tm: 55/55/60, GC%: 50/50/55 로 설정한다.

product size ranges를 조절해 만들어질 product의 bp를 정할 수 있다.

7. 우측 상단의 초록색 Pick primer를 클릭한다.

8. 도출된 여러 종류의 primer 중 가장 이상적인 primer를 선택한다.

※ product size(전체 primer 크기)가 100~150 bp 사이 값이면, ANY, SELF 값이 작으면 좋다.