cell thawing

1. 목적

freezing해둔 cell의 사용을 위해 녹인다.

2. 사용 재료

기구: pipette, pipette aid, tip, glass pipette, conical tube, T-flask, hemocytometer

시약: HBSS, DMEM-HG, trypan blue

3. 방법

① water bath에 HBSS, DMEM을 넣고 37℃로 설정해 데워둔다.

② 동결용 vial은 알코올로 닦은 후 clean bench 안에서 열었다 닫은 후 water bath에서 녹인다.

③ conical tube에 HBSS 10ml을 덜어둔다.

④ 동결용 vial이 다 녹기 전 water bath에서 꺼내 손의 열감으로 녹인다. 

⑤ cell을 천천히, 남김없이 HBSS에 넣는다.

⑥ HBSS(+cell)을 centrifuge 한다.

⑦ HBSS suction후 적당량의 DMEM-HG와 pipetting한다.

⑧ trypan blue와 cell lysate를 각 10μl씩 따서 hemocytometer를 이용해 cell counting한다.

⑨ T-flask working volume을 맞춰 DMEM-HG를 넣는다.

⑩ density 계산 후 pipetting해 T-flask에 seeding한다.

⑪ labeling하고 incubator에 둔다.

⑫ thawing 다음날 media change한다.

4. 고찰

① Full name

HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)

DMEM-HG(Dulbecco's Modified Eagle Medium- High Glucose)

② cell counting

hemocytometer는 1ml을 기준으로 한다.

위 사진에서 1mm 하나당 부피는 0.1μl이다. (0.1*1*1)

따라서 1ml로 맞추기 위해 10^4를 곱한다. (0.1μl*10^4 = 1000μl = 1ml)

-상세 계산식

(counting된 cell)*(넣은 DMEM-HG ml)*2(trypan blue 희석 보완)*10^4/(counting한 칸 수)