PCR 조건잡기

1. cDNA conc. 및 primer conc.는 datasheet를 참고해 최소로 잡아 고정하고 temp.를 조절해가며 조건을 잡는다.

※ 이 때 temp. 조건은 넓게 잡는다.

Ex) Tm값 55℃ 경우 50 53 55 또는 50 52 54 등으로 잡아 실험해본다. 1℃는 큰 차이가 나지 않는다.

 

2. 1. 조건으로 실험해도 적정 조건이 없는 경우에는 cDNA conc. 및 Temp.를 고정하고 primer conc.를 조절해가며 조건을 잡는다.

 

3. 2. 조건으로 실험해도 적정 조건이 없는 경우에는 primer conc. 및 Temp.를 고정하고 cDNA conc.를 조절해가며 조건을 잡는다.

 

※ 주의사항!!

모든 경우, multi peak가 뜨지 않는 조건을 사용해야 한다.

Multi peak가 뜨는 이유는 PCR condition or primer design의 문제일 수 있다.

(primer dimer일수도 있고 non-specific일수도 있다)

Condition의 문제라면 condition을 바꿔 실험하면 되고, design의 문제라면 primer를 다시 짜야 한다.

(dimer문제일 경우 primer conc.를 낮춰 사용하면 해결됨. non-specific일 경우 Tm을 올려 실험해야 함)