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1. cDNA conc. 및 primer conc.는 datasheet를 참고해 최소로 잡아 고정하고 temp.를 조절해가며 조건을 잡는다.

※ 이 때 temp. 조건은 넓게 잡는다.

Ex) Tm값 55℃ 경우 50 53 55 또는 50 52 54 등으로 잡아 실험해본다. 1℃는 큰 차이가 나지 않는다.

2. 1. 조건으로 실험해도 적정 조건이 없는 경우에는 cDNA conc. 및 Temp.를 고정하고 primer conc.를 조절해가며 조건을 잡는다.

3. 2. 조건으로 실험해도 적정 조건이 없는 경우에는 primer conc. 및 Temp.를 고정하고 cDNA conc.를 조절해가며 조건을 잡는다.

※ 주의사항!!

모든 경우, multi peak가 뜨지 않는 조건을 사용해야 한다.

Multi peak가 뜨는 이유는 PCR condition or primer design의 문제일 수 있다.

(primer dimer일수도 있고 non-specific일수도 있다)

Condition의 문제라면 condition을 바꿔 실험하면 되고, design의 문제라면 primer를 다시 짜야 한다.

(dimer문제일 경우 primer conc.를 낮춰 사용하면 해결됨. non-specific일 경우 Tm을 올려 실험해야 함)

1. 프로그램 사용하기

 pcr 프로그램상에서 나오는 RQ값을 바로 이용해 그래프를 만들 수 있다.

2. 계산식을 통해 RQ값 얻기

① 프로그램상에서 나온 data를 엑셀로 옮긴다.

(여기서 사용하는 값은 CT mean)

② 각각 sample에서 housekeeping gene의 CT값을 빼서 dCT의 값을 구한다.

(MSC는 MSC의 B-actin, DF는 DF의 B-actin값을 빼야 함)

③ 실험한 그룹의 dCT값에서 control 그룹의 dCT값을 빼 ddCT값을 얻는다.

(MSC는 control group이기 때문에 ddCT의 값이 0이 된다)

④ 2^(-ddCT)식을 이용해 RQ값을 구한다. 프로그램으로 구해진 RQ값과 동일한 것을 확인할 수 있다.

⑤ RQ값으로 그래프를 그린다.

① housekeeping gene을 넣은 그룹을 기준으로 잡는다.

(프로그램 설정 시 Reference sample은 negative control sample, endogenous control은 housekeeping gene을 넣는다)

② housekeeping gene의 CT값을 사용해 각 그룹의 CT값에서 dCT를 구한다.

dCT= CT(gene)-CT(B-actin 같은 control)

③ housekeeping gene을 넣은 control 그룹의 값을 뺀다.

ddCT= dCT (실험군) - dCT (negative control, 여기서는 MSC)

실험 그룹은 N.C 그룹보다 CT값이 작으므로 -값이, housekeeping gene 그룹은 0값이 나온다.

④ 2^(-ddCt)(=RQ)의 값을 구한다(이때 housekeeping gene 그룹의 값은 0이므로 2^(-ddCt)의 값은 1이 된다)

⑤ RQ값을 이용해 그래프를 그린다.

1. 목적

cell에 새로운 영양소 공급

2. 사용 재료

기구: pipette, tip, pipette aid, glass pipette, conical tube

시약: HBSS, media

3. 방법

① flask에 HBSS를 추가 후 washing한다.

② washing한 media를 conicla tube로 옮기고 centrifuge 한다.

③ cell을 suction하지 않게 주의하고, 상층액을 suction한다.

④ 적당량의 media를 pellet과 섞어준다.

⑤ trypan blue를 사용해 cell counting한다.

⑥ density를 계산하고, 적정량을 dish에 골고루 seeding한다.

4. 고찰

① rpm, rcf 변환 및 차이

rpm(rev per min)은 분당 회전수이며, 속도의 단위다. 로터의 길이가 다를 시 같은 rpm이라도 원심력이 다르다.

② HBSS pH

HBSS의 phenol red를 통해 pH를 짐작할 수 있다.

HBSS는 붉은색을 띠는데, 세포호흡으로 발생한 이산화탄소가 HBSS에 녹아 pH가 낮아지면(산), 노란색을 띤다.

pH가 높아지면(염기) 자주색을 띤다.

③ trypan blue 염색 원리

trypan blue 입자는 확산을 통해 세포 내로 유입된다. 살아있는 세포는 exocytosis 작용을 통해 trypan blue를 세포 밖으로 배출해 염색되지 않는다.

죽은 세포는 exocytosis 작용을 할 수 없어 파란색으로 염색된다.

1. 목적

cell에 새로운 영양소 공급

2. 사용 재료

기구: pipette, tip, pipette aid, glass pipette

시약: HBSS, media

3. 방법

① flask에 있는 old media를 suction한다.

② HBSS를 벽면을 따라 넣어 washing한다.

③ cell에 맞는 media를 넣어준다.

④ flaming후 incubator에 보관한다.

4. 고찰

① HBSS

HBSS는 cell washing용이나, 단기간 보관용으로 쓰이는 buffer이다. cell이 죽지 않을 정도의 salt가 포함되어있다.

1. 목적

freezing해둔 cell의 사용을 위해 녹인다.

2. 사용 재료

기구: pipette, pipette aid, tip, glass pipette, conical tube, T-flask, hemocytometer

시약: HBSS, DMEM-HG, trypan blue

3. 방법

① water bath에 HBSS, DMEM을 넣고 37℃로 설정해 데워둔다.

② 동결용 vial은 알코올로 닦은 후 clean bench 안에서 열었다 닫은 후 water bath에서 녹인다.

③ conical tube에 HBSS 10ml을 덜어둔다.

④ 동결용 vial이 다 녹기 전 water bath에서 꺼내 손의 열감으로 녹인다. 

⑤ cell을 천천히, 남김없이 HBSS에 넣는다.

⑥ HBSS(+cell)을 centrifuge 한다.

⑦ HBSS suction후 적당량의 DMEM-HG와 pipetting한다.

⑧ trypan blue와 cell lysate를 각 10μl씩 따서 hemocytometer를 이용해 cell counting한다.

⑨ T-flask working volume을 맞춰 DMEM-HG를 넣는다.

⑩ density 계산 후 pipetting해 T-flask에 seeding한다.

⑪ labeling하고 incubator에 둔다.

⑫ thawing 다음날 media change한다.

4. 고찰

① Full name

HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)

DMEM-HG(Dulbecco's Modified Eagle Medium- High Glucose)

② cell counting

hemocytometer는 1ml을 기준으로 한다.

위 사진에서 1mm 하나당 부피는 0.1μl이다. (0.1*1*1)

따라서 1ml로 맞추기 위해 10^4를 곱한다. (0.1μl*10^4 = 1000μl = 1ml)

-상세 계산식

(counting된 cell)*(넣은 DMEM-HG ml)*2(trypan blue 희석 보완)*10^4/(counting한 칸 수)